熒光分光光度計(jì)或熒光計(jì)是強(qiáng)大的分析工具。它們與紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)有相似之處，因?yàn)閮烧叨忌婕肮獗粶y(cè)試樣品中的特定分子吸收。然而，在熒光分光光度計(jì)中，由于被稱為熒光的現(xiàn)象在吸收后發(fā)出的光的強(qiáng)度被測(cè)量為波長(zhǎng)的函數(shù)，以產(chǎn)生熒光光譜。

熒光分光光度計(jì)的基本工作原理

　　所有分子都包含許多特定于特定分子的離散能級(jí)。在分子的基態(tài)中，它的電子占據(jù)可用的最低能級(jí)。然而，當(dāng)它們從光中吸收適當(dāng)?shù)哪芰繒r(shí)，它們可以過(guò)渡到更高的水平以形成激發(fā)態(tài)。這些本質(zhì)上是不穩(wěn)定的，因此電子會(huì)自發(fā)地回落到較低的水平。在這個(gè)過(guò)程中發(fā)出的光是熒光。

　　激發(fā)的電子可以回落到各種較低的能級(jí)或直接回到基態(tài)，導(dǎo)致能量發(fā)射低于或等于入射光能。因此，熒光光譜總是出現(xiàn)在比入射光束更長(zhǎng)的波長(zhǎng)處。由于熒光發(fā)射發(fā)生在各個(gè)方向，但強(qiáng)度遠(yuǎn)低于入射光束，因此熒光檢測(cè)器位通過(guò)測(cè)試樣品的光束路徑。這可以防止探測(cè)器被入射光束淹沒(méi)。

充分利用熒光分光光度法

　　雖然熒光強(qiáng)度發(fā)射比紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中的信號(hào)弱得多，但熒光計(jì)的檢測(cè)水平較低。這是因?yàn)闊晒庑盘?hào)是直接測(cè)量的。這與入射光束是分開(kāi)的，并且可以很容易地以低噪聲貢獻(xiàn)被放大。然而，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中檢測(cè)低濃度意味著測(cè)量大傳輸信號(hào)和原始入射光束之間的非常小的差異，這受到兩個(gè)光束中存在的噪聲的限制。

　　熒光計(jì)可以提供多種不同的測(cè)量選項(xiàng)：

　　高強(qiáng)度光源，一般覆蓋200~750 nm 波長(zhǎng)范圍，配備基于衍射光柵的單色儀，因此可以將入射光束的波長(zhǎng)調(diào)整到特定值。這意味著可以使用不同的激發(fā)能量來(lái)確定測(cè)試樣品中多種成分的濃度。

　　通過(guò)測(cè)量隨時(shí)間變化的熒光強(qiáng)度，可以計(jì)算出樣品池中發(fā)生的反應(yīng)速率

　　在掃描入射光的波長(zhǎng)時(shí)記錄一系列熒光光譜，可以建立 3 維掃描或激發(fā)發(fā)射矩陣，其中發(fā)射的熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)。這會(huì)生成一個(gè)熒光指紋可用于測(cè)量樣品的成分、濃度和環(huán)境負(fù)荷，用于檢查純度、原料異常、混合物成分、有機(jī)降解引起的新鮮度或確定原產(chǎn)地等。